锦鲤疱疹病毒病(koi herpesvirus disease, KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus, KHV)感染引起鲤(Cyprinus carpio)、锦鲤以及鲤变种鳃坏死和间质性肾炎的一种高传染性、高死亡率的疾病，致死率高达80%~100%^[1-3]。世界动物卫生组织(OIE)和中国都将KHVD列为必须申报的疾病，中国农业部将其列为Ⅱ类动物疫病^[4-5]。该病主要发生在春秋季，水温为18~28 °C易暴发^[6-7]。成鱼和幼鱼对KHV都敏感，小鱼(1~3月龄，2.5~6 g)的敏感性高于大鱼(1龄，约230 g)^[8]。1998年，在以色列、美国和德国最早报道KHV引起大面积鲤和锦鲤死亡，随后在欧洲、亚洲、非洲和澳大利亚都有锦鲤疱疹病毒病暴发^[1，9]，呈世界性流行与分布。2001年，中国香港最早暴发了KHVD，后来在广州、武汉、深圳、长春等东部沿海城市和地区有该病暴发的报道^[10]，2011年，KHV在辽宁省(KHV-cj)和广东省(KHV-GZ11)首次成功分离^[11-12]。然而，在我国西南地区还未见KHVD流行的报道，本研究首次报道KHV在我国西南地区暴发，并且实验成功分离得到病毒。

2015年5月，四川某养殖场鲤发生大面积死亡，发病鱼体表黏液增多，全身多处明显出血，眼球凹陷，鳃丝腐烂、出血、严重坏死。剖检后可见肝脏、肾脏肿大，然而从内脏器官未分离到细菌，并且通过实验证明不是寄生虫感染。根据临床特征和病理学观察，初步诊断为KHV感染，针对OIE推荐的KHVSph基因设计检测引物进行PCR检测，出现特异性扩增产物。为进一步验证是KHV导致鲤的大面积死亡，采集患病鱼组织病料接种CCB细胞，成功分离出一株KHV并且稳定传代。根据TK基因全长序列建立系统进化树，证实该病毒属于亚洲1型毒株，暂命名为KHV-SC株。本研究首次报道KHV在我国西南地区暴发流行。

1.   材料与方法

1.1   病料、细胞和实验对象

病鱼采集于2015年5月，来源于四川成都某鲤养殖场，体长25~35 cm。健康鲤(体长25~30 cm)40条，购自四川成都某鲤养殖场。普通鲤脑细胞系(CCB)由深圳出入境检验检疫局刘荭研究员馈赠。CCB细胞在含10% FBS的MEM培养基，25 °C 5% CO₂恒温培养箱中培养。

1.2   主要试剂

MEM培养基、胎牛血清购自Sigma公司；病毒DNA提取试剂盒、小剂量质粒抽提试剂盒、pMD19-T质粒连接试剂盒、组织DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自TaKaRa公司。

1.3   细菌学检查

对病鱼进行解剖观察，同时取肝脏、脾脏、肾脏和脑等组织器官于洁净载玻片上涂片，风干后革兰氏染色，显微镜观察。无菌条件下，从病鱼肝脏、脾脏和肾脏取样于BHI平板上划线接种，28 °C恒温培养24~48 h后观察细菌生长状况。

1.4   组织病理学

取病鱼的鳃、肾脏、肝脏、脾脏、脑和肠道等组织器官，10%的中性福尔马林固定，常规石蜡切片，H.E染色，中性树胶封片后光学显微镜下观察其主要病变并拍照记录。

1.5   人工感染动物实验

取濒死鲤的肝脏、肾脏组织，用无菌生理盐水以1∶5(重量体积比) 在冰上匀浆。4 °C下以3000、6000和9000 r/min依次梯度离心10 min; 取上清液于0.22 μm的滤膜过滤灭菌。将健康鲤分为2组，每组20尾。实验组每尾注射0.2 mL的组织匀浆液，对照组每尾注射0.2 mL无菌生理盐水，采用腹腔注射方式。实验期间水温控制在20~25 °C，每天观察2次，连续观察4周。

1.6   病毒分离培养和电镜观察

收集病鱼的肾脏、肝脏、脾脏等组织共3 g，加入10倍体积(V/W)含有双抗的细胞培养液(100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，使用全自动样品快速研磨仪(上海净信科技)研磨成组织匀浆液，4 °C过夜处理。4 °C，7000 r/min离心15 min，取出上清液，按照以上条件再离心2次。将上清液用MEM培养基进行10倍、100倍梯度稀释，取1 mL加入到单层细胞的培养瓶中，置于25 °C培养箱中，逐日观察细胞病变(CPE)，收集CPE达70%~80%的细胞及上清液，–80 °C保存备用。待接种病毒细胞CPE达到70%~80%时，刮取细胞，4000 r/min离心5 min，PBS洗涤细胞沉淀，加入2.5%戊二醛固定，按常规方法进行1%锇酸固定、乙醇脱水、环氧树脂包埋，超薄切片透射电镜观察。

1.7   PCR鉴定

发病鱼、人工感染鱼、健康鱼的组织DNA与感染CCB细胞的DNA提取按照提取试剂盒的说明进行操作。根据OIE推荐的鉴定锦鲤疱疹病毒的Sph基因进行检测。

引物设计与合成 根据GenBank公布的KHV美国株(KHV-U，ID:DQ657948.1)基因序列，选取保守的Sph基因(ORF54)，应用Primer 5与Oligo软件设计引物，F: 5′-GCCCAAGAGCTGCTGGTA-3′；R:5′-ACCTGCCTGCAGACAATCAT-3′，PCR扩增产物预期为690 bp。引物由成都擎科生物技术有限公司合成。

病毒DNA的提取与PCR鉴定 收集CPE病变达70%~80%的细胞培养物，按照病毒DNA提取试剂盒使用说明书提取DNA，并进行PCR扩增。PCR扩增体系(25 μL)：12.5 μL 2×PCR Master Mix，上游引物、下游引物各1 μL，模板2 μL，加ddH₂O至25 μL；扩增条件：94 °C预变性5 min；94 °C变性30 s，54 °C复性45 s，72 °C延伸45 s，35个循环；72 °C延伸5 min，用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，得到约0.7 kb的PCR产物。

1.8   TK基因全序列克隆测序及系统发育分析

TK基因是一段长约997~1007 bp，编码胸苷激酶的基因序列，国内外许多学者采用TK基因对KHV毒株进行系统发育分析^[11，13]。按照文献[11]介绍的方法合成一对扩增TK基因全序列的引物，上游引物：5′-AACGCGGGCCAGCTGAACAT-3′，下游引物：5′-TGTGTGTATCCCAATAAACG-3′，预期扩增片段大小为997~1007 bp。反应体系同步骤“病毒DNA的提取与PCR鉴定”；PCR扩增条件：94 °C预变性5 min；94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸60 s，共35个循环；72 °C延伸10 min。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后，按操作说明书连接到pMD19-T载体上，转化DH5α感受态细胞中。培养24 h后，挑取单个菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆菌株，提取质粒送成都擎科生物技术有限公司进行序列测定。将测序结果通过NCBI的Blast查找同源性序列，以FASTA格式下载并整合。采用MEGA 6.0的clustalw (codons)功能将整理序列排序，以置信度百分比(bootstrap replications)为1000，使用邻接法构建系统发育树。

2.   结果

2.1   解剖和细菌学检查

发病鱼体表黏液增多，全身多处明显出血，眼球凹陷，鳃丝腐烂、出血、严重坏死(图1)。剖检后可见肝脏、肾脏肿大。涂片检查未观察到细菌，也未从发病鱼的肝脏、脾脏和肾脏中分离到细菌。

图  1  病鱼鳃组织严重坏死

Figure  1.  Severe gill necrosis of sick fish

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2.2   组织病理学观察

采集患病鱼的外部器官(鳃)和内部器官(肾脏)制作病理切片观察。与对照组比较(图2-a)，病鱼鳃丝血管扩张充血，鳃小片呼吸上皮细胞肿胀、脱落。鳃丝基部的上皮细胞大量增生，层次增多，填充了1/3至1/2的鳃小片，并且向远端延伸(图2-b)。在内部器官的观察中，与对照组(图2-c)比较，肾小管上皮细胞组织结构紊乱，细胞肿胀，呈颗粒变性，管腔变狭小，有崩裂和坏死现象；病变周围间隙组织血管扩张充血，有大量炎性细胞渗出(图2-d)，与以往的研究结果一致^[1，14]。

图  2  鳃和肾脏的组织病理学损伤

a. 正常鱼鳃组织；b. 发病鱼鳃组织；c. 正常鱼肾脏；d. 发病鱼肾脏

Figure  2.  Histopathological lesions of gills and kidney

a. healthy gills; b. infected fish’s gills; c. healthy kidney; d. infected fish’s kidney

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2.3   人工感染实验

实验组鲤注射感染第3天开始出现临床症状，鱼变得冷漠不爱动，体表黏液分泌增多，食欲减退。第6天开始出现死亡，第14天累积死亡率达90%，连续观察3周。动物感染主要表现为急性死亡，出现与自然发病鱼相同的临床表现。对照组全部存活无异常(图3)。

图  3  组织悬液人工感染实验结果

Figure  3.  Results of artificial infection experiment with the tissue suspension

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2.4   病毒分离

病鱼组织匀浆滤菌并感染CCB细胞，盲传3代可以稳定地观察到典型的CPE，细胞单层呈破渔网状(图4-b)，而对照组CCB细胞生长致密且无空泡出现(图4-a)。将病毒分离株暂命名为KHV-SC。

图  4  CCB细胞接种病毒后产生病变

a. 对照；b. 感染的CCB细胞

Figure  4.  Cytopathogenic effects of CCB cells infected by virus

a. control cells; b. CCB cells infected with virus

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2.5   电镜观察

在透射电镜下可观察到细胞胞质内有大量成熟和不成熟的病毒粒子，将单个病毒粒子放大，其形态如小图所示(图5)。病毒为二十面体对称，有囊膜，直径为180~200 nm，呈现典型的疱疹病毒结构。

图  5  电镜下的病毒粒子

Figure  5.  The virons under electron microscope

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2.6   PCR鉴定

对2条自然发病和2条人工感染发病鱼的组织DNA和病毒细胞培养物的DNA进行PCR检测，凝胶电泳检测结果显示，扩增条带约700 bp，与预期相符(图6)。

图  6  PCR检测结果

M. DL2000 DNA marker；1~2. 自然发病鱼；3~4. 人工感染鱼；5. KHV感染细胞DNA；6. 健康鱼

Figure  6.  Detection results of PCR

M. DL2000 DNA marker; 1–2. DNA isolated from naturally infected fish tissue; 3–4. DNA isolated from experimentally infected fish tissue; 5. DNA isolated from infected cell; 6. DNA isolated from healthy fish tissue

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2.7   序列分析与进化树构建

将TK全长序列克隆到pMD19-T载体中，送成都擎科生物技术有限公司进行序列测定。结果显示，分离株TK基因全长997 bp。测序结果与GenBank中登录的KHV序列进行比较，依据邻接法利用MEGA 6.0建立进化树(图7)，证实本实验所分离的毒株为亚洲1型毒株(图7)，与日本株(J:AP008984)、印度尼西亚KO5(HM347098)和CO7(HM347099)株同源性均为100%。以色列毒株(I strain)与亚洲1型毒株同源关系较近，这与以往的研究报道一致^[15-16]。

图  7  基于TK基因利用邻接法构建KHV-SC进化树

Figure  7.  Phylogenetic tree of KHV-SC based on TK gene sequences

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3.   讨论

KHV感染的典型临床症状表现为行动迟缓、食欲不振、体表黏液增多、胸鳍及腹鳍出现出血斑、眼球凹陷，病鱼鳃局部或全部苍白并伴随不同程度的鳃坏死。解剖后可见脾脏、肾脏暗红并充血肿大，未从内脏中分离到细菌。典型的病理损伤表现为间质性肾炎、鳃小片上皮细胞肿胀、脱落，肾小管上皮细胞组织结构紊乱、细胞肿胀、管腔变狭小，有崩裂和坏死现象。Miwa等^[17]还发现病毒可在肾脏和鳃上皮细胞内形成包涵体。本次病例的临床症状和组织病理损伤与以前的报道基本一致^[18-19]。通过人工感染实验、PCR检测、病毒分离以及TK全基因系统发育分析，证实此次造成四川地区养殖鲤大面积死亡的病原为KHV。

目前，我国KHVD的流行和暴发主要集中在南部沿海和东北地区，如广东、黑龙江和吉林等，国内报道并成功分离的KHV病毒株有辽宁株(KHV-cj)、广东分离的广州株(KHV-GZ11和KHV-GZ1301)和黑龙江分离的KHV-hlj株等^[20]。本研究首次报道KHVD在我国西南地区暴发，并且成功分离得到了KHV-SC株。四川省是淡水鱼养殖大省，全省水产养殖面积19.61万hm²，水产品总产量达到137 万t，主要养殖鲤、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲫(Carassius auratus)、鳙(Aristichthys nobilis)、鲢(Hypophthalmictuthys molitrix)^[21]。锦鲤疱疹病毒病(KHVD)具有高传染性、高死亡率，死亡率达80%~100%，已在世界范围内流行，具有潜伏感染的特性^[22]，严重威胁全世界鲤和锦鲤养殖业的安全^[23]。

OIE推荐KHV的检测基因为TK和Sph。Sph属于保守性很强的聚合酶基因，有很好的特异性，能够将与CyHV-3亲缘关系很近的鲤痘疱疹病毒(CyHV-1)、金鱼造血器官坏死病病毒(CyHV-2)和鳗鱼疱疹病毒(AngHV)区别开^[24-25]。TK基因是一条长为997~1007 bp，编码胸苷激酶的基因，保守性强，突变点稳定，通过该基因可以对世界范围内的KHV毒株进行分型，国内外很多学者都采用了TK基因对KHV毒株进行系统发育树分析^{[11，13，26]}。Kurita等^[13]通过基因组学对世界范围内大量的KHV毒株进行分析，证明来自亚洲和欧洲的隔离群有着明显的基因差异，可通过对TK 基因全长序列的测定将KHV毒株区分为欧洲型和亚洲型，亚洲型分为亚洲1型和亚洲2型，欧洲型分为E1~E7共7个毒株型^[26]。本研究获得TK基因全长序列为997 bp，经MEGA 6.0构建进化树，表明KHV-SC属于亚洲1型毒株。本课题组首次从西南地区分离得到一株KHV，并且对其致病性进行了研究，为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供理论依据。