三角帆蚌谷胱甘肽硫转移酶基因克隆表达及其类胡萝卜素转运功能分析
为了阐明谷胱甘肽硫转移酶Pi类基因 (HcGSTP1) 在三角帆蚌类胡萝卜素转运中的作用，并探讨该基因表达与三角帆蚌壳色的相关性。本实验克隆并鉴定了三角帆蚌HcGSTP1基因，对其进行了序列特征和进化分析，通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 和原位杂交(ISH )技术检测了HcGSTP1基因在三角帆蚌中的表达及定位情况，利用RNAi技术对其功能及作用机制进行了初步分析。结果显示，HcGSTP1基因的全长cDNA序列为1 317 bp，其中开放阅读框(ORF)区为618 bp，编码205个氨基酸，包含一个GST-N-pi结构域和GST-C-Pi结构域。qRT-PCR结果显示，HcGSTP1基因在紫蚌肝胰腺和斧足中表达量极显著高于白蚌，且在紫蚌边缘膜和中央膜中表达量显著高于白蚌。原位杂交结果显示，HcGSTP1基因在外套膜的外褶、背膜区、腹膜区、部分中褶以及外褶与中褶连接处出现明显的阳性信号。RNAi技术结果显示，HcGSTP1基因在边缘膜中表达的干扰率达83.74%，同时发现边缘膜中总类胡萝卜素含量 (TCC) 降低了30.12%。上述实验结果初步证实HcGSTP1基因参与三角帆蚌类胡萝卜素的转运，进而可能会影响贝壳及珍珠呈色，为深入理解三角帆蚌类胡萝卜素转运及贝壳和珍珠颜色形成机制补充了分子依据。
Cloning and expression of glutathione S-transferase pi gene and analysis of carotenoid transport function in Hyriopsis cumingii
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三角帆蚌 (Hyriopsis cumingii) 作为中国淡水水域特有的育珠蚌，生产的淡水珍珠总量占全国70%以上[1]。然而珍珠品质不高是制约珍珠产业可持续发展的关键问题，其中，颜色是影响珍珠品质主要因素之一[2]。类胡萝卜素 (carotenoids) 是一类脂溶性的天然着色剂[3]，已有较多研究表明，类胡萝卜素代谢显著影响水生动物体色[4]，且珍珠颜色与类胡萝卜素密切相关[5-7]。大多数动物缺乏与类胡萝卜素合成相关的酶，因此只能从食物中摄取[8]。贝类中类胡萝卜素的代谢是个复杂的过程，其在体内吸收、转运、裂解的机制受多层次、多水平因素的调控，涉及多个关键基因。
已有较多研究表明SR-BI和CD36是参与类胡萝卜素吸收过程中的2个关键基因[9]，李雪[10]在虾夷扇贝 (Mizuhopecten yessoensis) 中发现SCD基因可增强类胡萝卜素的吸收；载脂蛋白 (APOL) 是一类参与动物体内类胡萝卜素转运过程的高密度脂蛋白，在马氏珠母贝 (Pinctada martensi) 中研究表明Pm-APOL3基因参与类胡萝卜素代谢[11]，同样在三角帆蚌中研究表明hcApo基因表达水平与类胡萝卜素含量呈显著正相关[12]。Beta-Carotene-15,15-monooxygenase (BCO1) 和Beta-Carotene-9,10-oxygenase (BCO2) 则是参与类胡萝卜素裂解过程中的2种关键酶[9]。除此之外，Wang等[13]研究证明LPCAT1基因可促进类胡萝卜素在虾夷扇贝闭壳肌中的积累；张进盼等[14]同样发现HcLPCAT1基因可以促进类胡萝卜素的储存，进而影响三角帆蚌内壳色的形成。总体而言，类胡萝卜素代谢的分子调控机制尚不是很清楚。类胡萝卜素具有亲脂性，因此需要通过类胡萝卜素结合蛋白等蛋白质在胞内运输[15]。其中，参与类胡萝卜素胞内转运的蛋白包括Pi isoform of human glutathione S-transferase (GSTP1)、carotenoid-binding protein (CBP) 与fatty acid-binding proteins (FABPs) 等[15]。GSTP1属于谷胱甘肽S-转移酶家族 (GSTs) 中的P类，可以编码S-转移酶家族的酶[16]。Bhosale等[17]研究表明GSTP1作为类胡萝卜素结合蛋白可将玉米黄素结合沉积到特定的组织细胞；程德伟[18]研究表明GSTP1基因编码的蛋白通过与类胡萝卜素结合从而推测其在类胡萝卜素转运过程中起关键作用。
为了阐明三角帆蚌HcGSTP1基因在类胡萝卜素代谢中的作用，本实验克隆并分析了三角帆蚌HcGSTP1基因的全长序列；通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 和原位杂交(ISH)技术探究了HcGSTP1基因在三角帆蚌中的表达及定位情况；利用RNAi技术抑制HcGSTP1基因的表达，以研究其与类胡萝卜素转运的相关性，为进一步分析贝壳、珍珠颜色形成机制提供分子基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用三角帆蚌均为课题组培育的三角帆蚌新品种，取自学校产学研合作基地，位于安徽铜陵东联新村，三角帆蚌“申浙3号”为白色内壳色简称“白蚌”，三角帆蚌“申紫1号”内壳色为紫色简称“紫蚌”，白蚌紫蚌且均为6月龄。挑选喷水有力、大小相近的健康个体，于实验室暂养7 d，水温保持在 (24 ± 2) °C，投喂普通小球藻 (Chlorella vulgaris) 且保持充氧。随机选取白蚌和紫蚌各3只，采集肝胰腺、闭壳肌、斧足、边缘膜和中央膜5个组织，分析HcGSTP1基因的组织表达差异。实验过程中操作人员严格遵守上海海洋大学伦理规范，并按照上海海洋大学伦理委员会制定的规章制度执行。
1.2 实验方法
总RNA提取及cDNA合成
采用TRIzol法分别提取白蚌、紫蚌不同组织，并借助分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量。基因克隆所用cDNA采用TaKaRa RACE试剂盒 (Code No. 634858) 合成，qRT-PCR所用cDNA采用TaKaRa 反转试剂盒 (Code No. RR047A) 合成，合成的cDNA于 −20 °C保存待用。
HcGSTP1基因的克隆及分析
根据三角帆蚌外套膜转录组数据库[19]中获取HcGSTP1基因的部分序列，并设计所需引物 (表1)。采用TaKaRa RACE试剂盒 (Code No.634858) 进行PCR扩增 (50 μL ) ，割胶回收，将产物连接到PMD19-T载体上并转化到大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α中，倒置培养 (过夜)。经菌落PCR验证后，样品送往生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序，测序结果经DNAMAN软件拼接得到HcGSTP1基因的全长序列。根据Zhang等[20]方法进行序列分析并构建三角帆蚌HcGSTP1基因氨基酸序列系统进化树。
表 1 HcGSTP 1基因实验所用引物Table 1. Primers for HcGSTP 1 gene experiments引物
primers序列 (5′-3′)
primer sequences (5′-3′)目的
purposeGSTP1-3′-outer TAATGATGGAGTGGAGGACTACCG 3′RACE扩增 GSTP1-3′-inner GAGATAGCCAACCGACCAAACA GSTP1-YG-F TGACGTCAAGGAAGGTGCTC qRT-PCR GSTP1-YG-R GGTCGGTTGGCTATCTCCTG EF1α-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC EF1α-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT GSTP1-YW-F TGACGTCAAGGAAGGTGCTC 原位杂交 T7-GSTP1-YW-R TAATACGACTCACTATAGGGGGTCGGTTGGCTATCTCCTG GSTP1-GRNAi-F GAAGACGTGAATTGCAGCGA RNAi干扰 T7-GSTP1-GRNAi-R TAATACGACTCACTATAGGGTTGATGTTTGGTCGGTTGGC GSTP1-GRNAi-R TTGATGTTTGGTCGGTTGGC T7-GSTP1-GRNAi-F TAATACGACTCACTATAGGGGAAGACGTGAATTGCAGCGA T7-GFP-GRNAi-F TAATACGACTCACTATAGGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG GFP-GRNAi-R CAGCAGGACCATGTGATCGCGC GFP-GRNAi-F AAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG T7-GFP-GRNAi-R TAATACGACTCACTATAGGGCAGCAGGACCATGTGATCGCGC HcGSTP1基因的表达分析
根据HcGSTP1基因的全长序列，以EF1α-F、EF1α-R为内参[19]，设计qRT-PCR的特异性引物 (表1)。根据TaKaRa荧光定量试剂盒 (Code No. RR820A) 进行qRT-PCR (每个样品进行3次重复实验)，检测白蚌、紫蚌不同组织中的基因表达。使用Excel软件进行数据处理，$2^{-\Delta \Delta C_T} $法计算相对基因表达量，在IBM SPSS Statistics和GraphPad-Prism-7.0软件下进行显著性差异和作图分析。
设计原位杂交特异性引物 (表1) 并制备探针 (−80 °C保存备用)。取紫蚌外套膜组织固定在4%多聚甲醛溶液中，浸泡约14 h，经过脱水、透明、浸蜡、包埋等一系列步骤制备石蜡切片。杂交过程参照敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ (碱性磷酸酶) 说明书进行，研究镜下观察实验结果并拍照记录。
RNA干扰
根据HcGSTP1基因设计RNA干扰特异性引物，需分别在正反引物5′端添加T7启动子 (表1)。经PCR扩增 ( 50 μL、模板为肝胰腺cDNA) 和胶回收后，用T7试剂盒 (JT101-01) 合成干扰链。随机选取6月龄紫蚌并分为3组 (每组10只紫蚌)：实验组 (注射GSTP1-GRNAi干扰链)、空白对照组 [注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)] 以及阴性对照组 (注射GFP-GRNAi干扰链)，每只紫蚌注射总物质的量为60 µg的干扰链 (注射部位为闭壳肌)。48 h后取边缘膜组织，用于qRT-PCR和总类胡萝卜素含量检测。参考孙明龙等[21]的方法对类胡萝卜素含量进行检测。
2. 结果
2.1 HcGSTP1基因序列特征和进化分析
HcGSTP1基因全长cDNA为1 317 bp (GenBank：OP 963708，图1)，由56 bp 5′-UTR、643 bp 3′-UTR和618 bp 开放阅读框(ORF)组成，编码了205个氨基酸；经InterPro预测其在3~74 氨基酸(AA)处为GST-N-Pi 结构域和83~205 AA处为GST-C-Pi结构域，这2个结构域是GSTs家族典型的功能域，说明该基因属于Pi类GST [16]。Expasy预测该蛋白的分子量约为23.38 ku和理论等电点为6.90，氨基酸组成中亮氨酸含量最高，为12.70%。
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图 1 HcGSTP 1基因cDNA序列及其编码氨基酸序列方形框中ATG和TAA分别代表起始密码子和终止密码子。下划线部分代表GST-N-Pi (3-74 AA) 结构域；阴影部分代表GST-C-Pi (83-205 AA) 结构域；矩形框aataaa表示加尾信号位点。Figure 1. cDNA sequence and encoded amino acid sequence of HcGSTP 1 geneIn the square box, ATG and TAA represent start and stop codon. The underline part represents the GST-N-Pi (3-74 AA) domain; the shaded part represents the GST-C-Pi (83-205 AA) domain; rectangular box aataaa represents tail signal site.基于氨基酸序列同源性分析，三角帆蚌与褶纹冠蚌 (Cristaria plicata) 的同源性最高，为95.12%。BioEdit多序列比对结果显示，三角帆蚌HcGSTP1基因与褶纹冠蚌结构域相似度最高。以斑马鱼 (Danio rerio) 和大西洋鲑鱼 (Salmo salar) 为外群，与其他贝类物种GSTP1基因氨基酸序列比对后构建的进化树显示，三角帆蚌HcGSTP1氨基酸序列与褶纹冠蚌最接近，聚为一个类群，关系最近；其次与紫贻贝 (Mytilus edulis)、欧洲牡蛎 (Ostrea edulis) 和菲律宾帘蛤 (Ruditapes philippinarum) 聚为一大支，与腹足纲的中华圆田螺 (Cipangopaludina cathayensis) 相似较低 (图2、图3)，基因进化关系与物种分类地位基本一致。总体而言进化较为保守。
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图 2 GSTP1基因与其他物种氨基酸序列比对颜色的深浅代表蛋白序列相似的程度，颜色越深代表相似的程度越高。Figure 2. Amino acid sequence alignment of GSTP1 genes with other speciesThe depth of color represents the degree of similarity of the protein sequence, and the darker the color represents a higher degree of similarity.![]()
图 3 GSTP1基因氨基酸序列在不同物种中构建的NJ系统进化树Figure 3. Phylogenetic tree of GSTP1 amino acid sequence in different species2.2 HcGSTP1基因在不同壳色三角帆蚌的组织差异表达
HcGSTP1基因在白蚌紫蚌各组织中均有表达，但其在不同组织中的表达水平存在显著差异，在紫蚌的肝胰腺和斧足中表达量最高。HcGSTP1基因在紫蚌的肝胰腺和斧足中的表达量极显著高于白蚌 (P<0.01)，HcGSTP1基因在紫蚌的中央膜和边缘膜中的表达量显著高于白蚌 (P<0.05)，但在闭壳肌中的表达量无显著差异 (P>0.05) (图4)。
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图 4 HcGSTP 1在白蚌紫蚌各组织中的相对表达水平H. 肝胰腺，MC. 中央膜，PM. 边缘膜，AM. 闭壳肌，F. 斧足；“*”表示差异显著 (P<0.05)，“**”表示差异极显著 (P<0.01)；下同。Figure 4. The relative expression level of HcGSTP 1 in various tissues of white and purple musselH. hepatopancreas, MC. middle mantle, PM. fringe mantle, AM. adductor muscle, F. foot; “*” indicate the significant difference in the level of P<0.05 , ”**” indicate the significant difference in the level of P<0.01; the same below.2.3 HcGSTP 1基因在外套膜组织空间表达特征
利用合成的RNA探针，对三角帆蚌外套膜切片进行原位杂交实验。结果显示，HcGSTP1基因在外套膜边缘均有表达。其中，外褶、腹膜区、背膜区、外褶与中褶连接处以及部分中褶 (OF、VM、DM、MF) 阳性信号强于内褶 (IF) (图5-a)。阴性对照的相应组织中均无杂交信号 (图5-b)。
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图 5 三角帆蚌外套膜中HcGSTP 1基因的表达定位(a)阳性信号定位图，(b)阴性对照；IF. 内褶，MF. 中褶，OF. 外褶，DM. 背膜区，VM. 腹膜区。Figure 5. Expression and localization of HcGSTP 1 in the mantle of H. cumingii(a) the location map of positive signal, (b) the negative control; IF. inner fold, MF. middle fold, OF. outer fold, DM. dorsal mantle, VM. ventral mantle.2.4 干扰HcGSTP 1基因后三角帆蚌边缘膜组织类胡萝卜素含量变化分析
在dsRNA干扰后的紫蚌边缘膜组织的cDNA中，通过qRT-PCR检测HcGSTP1基因的相对表达量 (图6)。结果显示，实验组HcGSTP1基因的表达量较空白对照组和阴性对照组显著降低 (P<0.05)，降低83.74%，干扰链成功抑制了HcGSTP1基因的表达。
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图 6 干扰实验HcGSTP 1在紫蚌边缘膜中的表达Figure 6. The expression of HcGSTP 1 in the fringe mantle of purple mussel in interference experiment检测干扰48 h后三角帆蚌边缘膜组织中总类胡萝卜素的含量 (TCC)。结果显示，注射PBS组测量的TCC (表2) 为 (33.47±0.13) μg/g，注射GFP组和注射干扰链组后测量的TCC分别为 (33.21±0.19) μg/g和 (23.39±0.27) μg/g。类胡萝卜素含量在2个对照组间无显著差异 (P>0.05)，但RNAi组类胡萝卜素含量比对照组显著降低 (P<0.05)，降低了30.12%。说明HcGSTP1基因的表达可能会影响类胡萝卜素在三角帆蚌体内转运过程。
表 2 干扰后紫蚌边缘膜中TCC测定Table 2. Changes of TCC in fringe mantle of purple mussel in interference experiment组别 groups TCC/(μg/g) PBS 33.47±0.13a GFP 33.21±0.19a dsRNAi 23.39±0.27b 注：字母相同表示差异不显著 (P>0.05)，字母不同表示差异显著 (P<0.05)。
Notes: The same letters indicate no significant difference (P>0.05), with different letters indicating significant difference (P<0.05).3. 讨论
HcGSTP1基因进化较保守，同褶纹冠蚌、欧洲牡蛎及紫贻贝[22]等双壳贝类一样，三角帆蚌HcGSTP1基因包含GSTs家族典型的功能域—GST-N-pi结构域和GST-C-Pi结构域，说明该基因属于pi类GST[16]。根据系统进化树，淡水双壳贝类三角帆蚌HcGSTP1与褶纹冠蚌GSTP1首先聚为一个分支，然后与海水双壳贝类 (紫贻贝、欧洲牡蛎及菲律宾帘蛤) 聚为一大支，最后与腹足纲中华圆田螺聚为一支，表明淡水双壳贝类与海水双壳贝类进化的独立性，在类胡萝卜素代谢机制方面可能存在不同功能；就淡水鱼与海水鱼在类胡萝卜素代谢机制方面而言有很大差异，如金鱼 (Carassius auratus)、锦鲤 (Cyprinus carpio) 和红鲤 (C. flammans) 等大部分淡水鱼类能将类胡萝卜素转化虾青素，鲑鳟等海水鱼类却因缺乏转化类胡萝卜素的功能会直接将其储存在体内[23]。本研究中，与白蚌相比，HcGSTP1基因在紫蚌肝胰腺和斧足中表达极显著高 (P<0.01)，已有研究表明在三角帆蚌中肝胰腺的类胡萝卜素含量比其他组织高，且肝胰腺在类胡萝卜素沉积和转化中起重要作用[7]。在栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 中，CfGSTpi基因在组织间均有表达且存在差异，在消化腺中表达水平最高，闭壳肌中表达最低[24]，这一结果与本研究紫蚌组织表达谱一致。李庆昌[25]研究表明波纹巴非蛤 (Paphia undulata) 斧足较其他组织类胡萝卜素含量高，结合本研究结果，我们推测三角帆蚌在斧足中类胡萝卜素含量会较高；张进盼等[14]研究发现，HcLPCAT1基因在白蚌紫蚌中斧足中显著高表达，说明斧足可能在类胡萝卜素转运过程充当重要角色。此外，HcGSTP1基因在紫蚌的中央膜和边缘膜中的表达量显著高于白蚌 (P<0.05)，而外套膜在贝壳和珍珠的形成和着色中起作用[12, 26]。因此，HcGSTP1基因在紫蚌的肝胰腺、斧足和外套膜显著高表达，说明该基因可能参与类胡萝卜素转运，并可能与三角帆蚌贝壳和珍珠的形成及呈色密切相关。然而，有关HcGSTP1基因在不同组织中表达量差异的原因及生物学功能还有待进一步研究。
有研究表明GSTP1通过结合类胡萝卜素在类胡萝卜素转运过程中发挥重要作用。类胡萝卜素主要以蛋白质结合的形式存在于食物中，在动物体内被消化酶分离，然后在十二指肠中与其他脂质乳化形成乳糜颗粒，最后借助载体转运或被动扩散吸收[27]。目前发现，由于类胡萝卜素的疏水性，无论是无脊椎动物还是植物，其体内的类胡萝卜素往往是和蛋白质相结合，形成类胡萝卜素结合蛋白，从而便于类胡萝卜素的稳定。靳远祥等[28]总结了类胡萝卜素结合蛋白在类胡萝卜素转运过程中发挥重要作用，继而通过dsRNA对体内的HcGSTP1进行RNA干扰后，各组织的荧光定量检测表明，该基因的表达被成功抑制，干扰效果显著；与注射PBS的空白对照组相比有明显下降趋势；与此同时，总类胡萝卜素含量也显著降低。综上所述，HcGSTP1基因在三角帆蚌中的表达水平与TCC呈显著正相关，HcGSTP1基因的高表达可以促进类胡萝卜素在三角帆蚌中的积累，进一步说明该基因参与了三角帆蚌体内类胡萝卜素的转运过程。鉴于Bhosale等[17]的研究表明，GSTP1作为一种类胡萝卜素结合蛋白，可以将玉米黄质结合沉积到特定的组织细胞；Vachali等[29]基于表面等离子共振(SPR)的生物传感技术证明GSTP1与玉米黄质(类胡萝卜素的一类)转运有关；程德伟[18]推测该基因是类胡萝卜素转运过程中的关键基因。由于不同物种类胡萝卜素代谢功能不同，HcGSTP1基因结合类胡萝卜素的类型和代谢途径有待进一步研究。综上所述，推测HcGSTP1可能作为玉米黄质结合蛋白参与了三角帆蚌类胡萝卜素的转运。
原位杂交技术分析发现，HcGSTP1基因杂交信号主要存在于三角帆蚌边缘膜的外褶、腹膜区、背膜区、部分中褶及外褶与中褶连接处。已有学者证明外套膜的中褶和外褶内的壳皮沟以及中褶主要负责分泌蛋白质，形成角质层；腹膜处和外褶内外上皮细胞主要分泌有机质，形成棱柱层；背膜处细胞主要分泌有机基质，形成珍珠层[30-31]，且壳色的形成与珍珠层的颜色密切相关[32]，这表明HcGSTP1基因参与了贝壳角质层、棱柱层和珍珠层的形成，进而影响壳色的形成。因此推测，HcGSTP1基因可以通过影响类胡萝卜素转运过程进而影响三角帆蚌贝壳和珍珠的颜色的形成。关于HcGSTP1基因在珍珠呈色方面的具体机制还不清楚，期望后来学者能够深入研究。
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图 1 HcGSTP 1基因cDNA序列及其编码氨基酸序列
方形框中ATG和TAA分别代表起始密码子和终止密码子。下划线部分代表GST-N-Pi (3-74 AA) 结构域；阴影部分代表GST-C-Pi (83-205 AA) 结构域；矩形框aataaa表示加尾信号位点。
Figure 1. cDNA sequence and encoded amino acid sequence of HcGSTP 1 gene
In the square box, ATG and TAA represent start and stop codon. The underline part represents the GST-N-Pi (3-74 AA) domain; the shaded part represents the GST-C-Pi (83-205 AA) domain; rectangular box aataaa represents tail signal site.
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图 2 GSTP1基因与其他物种氨基酸序列比对
颜色的深浅代表蛋白序列相似的程度，颜色越深代表相似的程度越高。
Figure 2. Amino acid sequence alignment of GSTP1 genes with other species
The depth of color represents the degree of similarity of the protein sequence, and the darker the color represents a higher degree of similarity.
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图 3 GSTP1基因氨基酸序列在不同物种中构建的NJ系统进化树
Figure 3. Phylogenetic tree of GSTP1 amino acid sequence in different species
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图 4 HcGSTP 1在白蚌紫蚌各组织中的相对表达水平
H. 肝胰腺，MC. 中央膜，PM. 边缘膜，AM. 闭壳肌，F. 斧足；“*”表示差异显著 (P<0.05)，“**”表示差异极显著 (P<0.01)；下同。
Figure 4. The relative expression level of HcGSTP 1 in various tissues of white and purple mussel
H. hepatopancreas, MC. middle mantle, PM. fringe mantle, AM. adductor muscle, F. foot; “*” indicate the significant difference in the level of P<0.05 , ”**” indicate the significant difference in the level of P<0.01; the same below.
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图 5 三角帆蚌外套膜中HcGSTP 1基因的表达定位
(a)阳性信号定位图，(b)阴性对照；IF. 内褶，MF. 中褶，OF. 外褶，DM. 背膜区，VM. 腹膜区。
Figure 5. Expression and localization of HcGSTP 1 in the mantle of H. cumingii
(a) the location map of positive signal, (b) the negative control; IF. inner fold, MF. middle fold, OF. outer fold, DM. dorsal mantle, VM. ventral mantle.
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图 6 干扰实验HcGSTP 1在紫蚌边缘膜中的表达
Figure 6. The expression of HcGSTP 1 in the fringe mantle of purple mussel in interference experiment
表 1 HcGSTP 1基因实验所用引物
Table 1 Primers for HcGSTP 1 gene experiments
引物
primers序列 (5′-3′)
primer sequences (5′-3′)目的
purposeGSTP1-3′-outer TAATGATGGAGTGGAGGACTACCG 3′RACE扩增 GSTP1-3′-inner GAGATAGCCAACCGACCAAACA GSTP1-YG-F TGACGTCAAGGAAGGTGCTC qRT-PCR GSTP1-YG-R GGTCGGTTGGCTATCTCCTG EF1α-F GGAACTTCCCAGGCAGACTGTGC EF1α-R TCAAAACGGGCCGCAGAGAAT GSTP1-YW-F TGACGTCAAGGAAGGTGCTC 原位杂交 T7-GSTP1-YW-R TAATACGACTCACTATAGGGGGTCGGTTGGCTATCTCCTG GSTP1-GRNAi-F GAAGACGTGAATTGCAGCGA RNAi干扰 T7-GSTP1-GRNAi-R TAATACGACTCACTATAGGGTTGATGTTTGGTCGGTTGGC GSTP1-GRNAi-R TTGATGTTTGGTCGGTTGGC T7-GSTP1-GRNAi-F TAATACGACTCACTATAGGGGAAGACGTGAATTGCAGCGA T7-GFP-GRNAi-F TAATACGACTCACTATAGGGAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG GFP-GRNAi-R CAGCAGGACCATGTGATCGCGC GFP-GRNAi-F AAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG T7-GFP-GRNAi-R TAATACGACTCACTATAGGGCAGCAGGACCATGTGATCGCGC 
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表 2 干扰后紫蚌边缘膜中TCC测定
Table 2 Changes of TCC in fringe mantle of purple mussel in interference experiment
组别 groups TCC/(μg/g) PBS 33.47±0.13a GFP 33.21±0.19a dsRNAi 23.39±0.27b 注：字母相同表示差异不显著 (P>0.05)，字母不同表示差异显著 (P<0.05)。
Notes: The same letters indicate no significant difference (P>0.05), with different letters indicating significant difference (P<0.05).
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