抗菌素对草鱼肠道免疫和菌群的影响
为探究抗菌素对草鱼免疫和肠道菌群的影响,本实验以草鱼为研究对象,设置基础饲料 (对照组)、基础饲料添加恩诺沙星或氟苯尼考3组饲料,投喂草鱼2周后,通过肠道酶活检测、荧光定量 PCR (qRT-PCR) 和高通量测序技术分析饲料中添加抗菌素对草鱼肠道免疫及肠道菌群多样性影响。分析结果显示, (1)饲料中添加恩诺沙星和氟苯尼考降低了草鱼肠道谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)、过氧化氢酶 (CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)的含量,提高丙二醛 (MDA)的含量,导致草鱼肠道氧化应激。 (2)氟苯尼考组中的TNF-α、IL-1β、IL-12、NF-κB-P65、MHCⅡ、sIgM等免疫因子和ZO-1、ZO-2、occludin、CLDN-1、JAM3等黏膜相关蛋白的mRNA表达量显著下降,恩诺沙星组的免疫因子TNF-α、IL-1β、IL-12、TLR4、MHCⅡ 和黏膜相关基因ZO-2、occludin、CLDN-1、JAM3的mRNA表达量显著下降。 (3)通过16S rRNA高通量测序来揭示拌食投喂抗菌素对草鱼肠道微生物群落结构的影响,分析结果显示,饲料中添加恩诺沙星或氟苯尼考对草鱼肠道α多样性无显著差异,但对β多样性出现显著变化,表明2种抗菌素对肠道菌群丰富度没有显著影响,但会改变群落多样性。综上所述,饲料中添加恩诺沙星和氟苯尼考会导致草鱼肠道氧化应激、调控黏膜免疫应答,并影响肠道菌群的结构与多样性。本研究为草鱼病害防控相关研究及草鱼的绿色健康养殖提供了参考。
Effects of antimicrobials on intestinal immunity and microflora in grass carp (Ctenopharyngodon idella)
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脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)是脂肪酶家族的一员,能够水解甘油三酯,释放游离脂肪酸和单酰甘油,供组织吸收利用或储存在脂肪组织中[1],动物组织脂肪沉积主要取决于组织中的脂肪合成与分解,甘油三酯的分解速率在此过程中发挥着重要作用,在甘油三酯分解的过程中,LPL起着关键的调控功能,LPL常以同源二聚体的形式发挥甘油三酯水解酶和在受体介导的脂蛋白摄入时作为配体和桥接因子的双重功能。LPL最初作为“清除因子脂肪酶”在狗(Canis lupus familiaris)体内被发现[2-3],并在1966年被正式命名为脂蛋白脂肪酶[4]。1987年,Wion等[5]克隆了人(Homo sapiens) LPL基因,全长约36 kb,包含10个外显子和9个内含子,编码448个氨基酸的糖蛋白,分子量约为55 ku,包含N末端和C末端2个高度保守的结构域,N端含有Ser132-His241-Asp156催化三联体,C端含有对结合脂蛋白至关重要的肝素结合区[6]。研究表明,LPL参与了多种疾病的发生发展,如动脉粥样硬化[7-8]、高血压[9]、糖尿病[10]等。
多种鱼类的LPL基因已被挖掘研究,包括斑马鱼(Danio rerio)[11]、真鲷(Pagrus majors)[12]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[13]、金头鲷(Sparus aurata)[14]、草鱼(Ctenopharyngodon idella)[15]、鲤(Cyprinus carpio)[16]等。鱼类LPL表达广泛,肝脏、脂肪、肌肉、心脏、肾脏、肠道和性腺等组织中均有表达[16-17],其中肝脏和脂肪组织中的表达量相对较高,肾脏、肠道等组织的表达量较低[16-19]。基于鱼类中的多倍化现象[20],在真鲷[21]、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)[22]、克拉克钩吻鳟(Oncorhynchus clarkii)[23]、青鳉(Oryzias latipes)[24]等多倍体鱼类中挖掘到了2种LPL同源基因(LPL1和LPL2),研究表明,LPL1在肝脏、脂肪、肌肉等组织中的表达量是LPL2的10倍以上[22],表明同源基因在进化过程中表达特性和功能出现了差异[25-27]。研究表明,LPL表达水平受到营养和激素等多方面的调控,Oku等[21]测定了饥饿和再投喂对LPL表达影响,表明LPL的表达受到营养状况的调控。
重组蛋白表达中,分子伴侣是一类能够帮助其他蛋白质正确折叠的蛋白质,是外源基因在异源系统中稳定表达的调节器[28-29]。大肠杆菌(Escherichia coli)17-kilodalton protein由skp基因编码,具有分子伴侣的功能[30-31]。大肠杆菌SlyD蛋白具有双结构域,分别是FKBP结构域和IF结构域,IF结构域主要发挥分子伴侣的作用[32-33]。将Skp和SlyD作为分子伴侣用于原核重组蛋白表达系统,可促进目标蛋白的可溶性。
鲤是我国重要的大宗淡水养殖鱼类,是典型的四倍体生物,其基因组测序已完成,为功能基因的研究奠定了良好基础。已有的关于鲤LPL基因的研究仅报道了单个基因的cDNA序列和表达特征[16],鲤LPLs同源基因报道并不全面;且鱼类中LPLs蛋白酶活性的研究较为缺乏。本实验通过鲤基因组搜索,系统发掘鲤LPLs同源基因,研究其基因特征、时空表达分布;构建含Skp和SlyD融合标签的鲤LPLs重组蛋白表达系统,并测定了重组同源蛋白的酶活性,为探究鱼类LPL基因功能奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料与取样方法
鲤采自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地。用于摄食、饥饿及重摄食的实验鲤平均体重为(43.0 ± 5.5) g,于养殖室循环水养殖系统内暂养10 d,水温控制在25 °C,pH为7.2~7.6,每天定时投喂饲料,投喂量约为鲤体重的1%。实验过程中操作人员严格遵守实验动物伦理规范,并按照南京农业大学实验动物福利与伦理委员会制定的《南京农业大学实验动物管理办法》执行。
鲤组织取样
为验证CcLPLs基因表达分布,实验随机取3尾鱼,对其进行麻醉后取样,取肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑、肠、脾脏7个组织−80 °C冰箱保存。
鲤摄食、饥饿及重摄食组取样
为测定饥饿和重摄食对CcLPLs的影响,我们设计了投喂组(正常投喂)、饥饿组(禁食)和再投喂组(禁食后再投喂),具体实验设计和取样时间见表1。每个实验组每个时间点取随机取3尾实验鱼,每尾实验鱼取肝脏、背部肌肉、腹部脂肪3个组织,−80 °C冰箱保存。
分组
groups实验设计及取样
experiment design and sampling time投喂组
feeding group投喂后1、3、6和24 h取样 饥饿组
starvation group分别在饥饿174、192、342和360 h取样 再投喂组
refeeding group再投喂54和72 h取样 1.2 鲤LPLs基因同源搜索及引物设计
通过在鲤基因组(ASM1834038v1)中进行同源搜索,获取鲤LPLs同源基因。CcLPLA1a和CcLPLA1b具有相同的核苷酸序列和氨基酸序列,因此文中统称为CcLPLA1s。以获得的鲤LPLs CDS序列为模板,使用NCBI Primer-Blast及Primers 6.0软件设计鲤3种CcLPLs (CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa)特异性引物(表2)。引物对CcLPLA1s-F/R、CcLPLA2a-F/R、CcLPLBa-F/R分别为鲤CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa组织表达荧光定量PCR(qPCR)定量引物;β-actin-F/R为qPCR内参基因引物。LPL1-F/R、LPL2-F/R、LPLB-F/R分别为CcLPLA1a、CcLPLA2a和CcLPLBa基因片段PCR扩增引物,用于重组蛋白质粒构建;Skp-F/R、SlyD-F/R分别为PCR扩增大肠杆菌skp和slyD基因片段PCR扩增引物,用于重组蛋白质粒构建。所有引物由无锡亦欣生物科技有限公司合成。
引物
primers引物序列(5′-3′)
nucleotide sequence (5′-3′)CcLPLA1s-F GCAACTTCGATTGAACCAGCG CcLPLA1s-R CTGGATGAAGTTACATTCTTTGATGG CcLPLA2a-F GTCTGTTCGTCGCTGCTCTGG CcLPLA2a-R GCTGCAGCTGTTGAGAGTCTCTG CcLPLBa-F GCATTTTCTCTTATTGCGAGCGA CcLPLBa-R GAAGTTGCAGTCCGAAATAGAGTCC LPL1-F CGGAATTCGCAACTTCGATTGAACCAG LPL1-R CCGCTCGAGTCACTCGGTGCTCTGTTTGAA LPL2-F CGGAATTCGAAAAAGAAATTTTCAGCAAT LPL2-R CCGCTCGAGTTACTGGCTTTTCAGCTTCG LPLB-F CGGAATTCCCAATCAGCAATAGCACCCAAG LPLB-R CCGCTCGAGTTAATAGAAGCGCAGCGCGTT Skp-F GGAATTCCATATGGCTGACAAAATTGCAATC Skp-R CCGGAATTCTTTAACCTGTTTCAGTACGTCGGCAG SlyD-F GGAATTCCATATGAAAGTAGCAAAAGACC SlyD-R CCGGAATTCGTGGCAACCGCAACCG β-actin-F CGCCCCAGACATCAGGGTG β-actin-R GTGTTGAAGGTCTCAAACATGATCTGTG 1.3 鲤LPLs序列分析
鲤及其他鱼类LPLs基因所在连锁群信息来自NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov),使用Genomicus(v95.01)[34]对鱼类LPL基因进行共线性分析。使用DNAMAN 7.0软件对3种鲤CcLPLs氨基酸序列与其他物种氨基酸序列进行同源性比对分析。
1.4 总RNA提取、逆转录和qPCR
不同组织总RNA的提取依照总RNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek,上海)说明书进行,并通过分光光度计测定总RNA OD260/280值及对总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳来检测纯度和完整性。按照Primer ScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa,大连)合成cDNA。qPCR使用荧光定量试剂盒SYBR® Premix Ex Taq ⅡTM(TaKaRa,大连)。
1.5 原核重组表达质粒的构建及表达纯化
Skp-pET和SlyD-pET原核表达载体的构建
分别以Skp-F/R和SlyD-F/R为引物,大肠杆菌为模板,PCR分别获得skp和slyD基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,进行切胶纯化回收。使用限制性酶切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ对pET43.1质粒、Skp和SlyD进行双酶切,连接,构建Skp-pET和SlyD-pET载体。
Skp-CcLPLs-pET和SlyD-CcLPLs-pET重组质粒的构建
选取鲤CcLPLA1a、CcLPLA2a和CcLPLBa进行重组蛋白表达。分别以LPL1-F/R、LPL2-F/R和LPLB-F/R为引物(表2),以鲤cDNA为模板,PCR分别扩增3个CcLPLs基因,经琼脂糖凝胶电泳后,进行切胶回收。使用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对Skp-pET载体、SlyD-pET载体和3种CcLPLs基因片段进行双酶切,连接,构建Skp-CcLPLs-pET和SlyD-CcLPLs-pET重组质粒。将各重组质粒转化至DH5α感受态细胞中,使用菌液PCR筛选阳性单克隆,并送至亦欣生物科技(上海)有限公司进行测序验证。经验证正确后,对菌液进行扩培,使用质粒提取试剂盒(TaKaRa,大连)提取质粒。
重组质粒的原核表达
将成功构建的各重组质粒,分别转化至Transetta (DE3)感受态细胞(北京全式金生物有限公司)中,挑取阳性单克隆至10 mL氨苄抗性的LB液体培养基中,37 °C,200 r/min摇约12 h,以1∶100的比例扩大培养2~3 h,待OD600值在约0.6时,加入终浓度0.1 mmol/L IPTG诱导剂,诱导12 h,5 000 r/min离心15min收集细菌沉淀,加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)(碧云天生物科技有限公司)的裂解液进行超声,超声后,12 000 r/min离心15 min,分别收集上清液和沉淀,将总菌和超声后的上清液进行SDS-PAGE电泳。
重组蛋白纯化
分别将非变性上清液和经尿素裂解液溶解变性后的上清液,通过0.22 µm滤膜过滤后,使用镍柱(碧云天生物科技有限公司)亲和层析的方法纯化目的蛋白,反复上柱3次,并依次通过不同浓度的咪唑非变性裂解液洗脱目的蛋白。
1.6 三种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性测定
采用对硝基苯酚法测定3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性[35]。在30 °C,pH 8.0条件下,分别测定3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性,每组设置3个平行。
1.7 三种CcLPLs重组蛋白的酶特性
pH对CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性的影响
为研究pH对鲤重组脂蛋白脂肪酶活性的影响,实验控制反应温度为30 °C[35]。分别加入等浓度的重组蛋白,分别用HCl和NaOH调节各体系pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,最后加Tris-HCl至体系体积为220 µL,每组设置3个平行,设置1组用灭菌水替代蛋白样品的对照组,30 °C条件下孵育5 min,在410 nm处测定各孔吸光值,记录孵育后的初始吸光值,往后每10 min记录一次吸光值,反应60 min后终止反应。
NaCl对CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性的影响
为研究NaCl对鲤重组脂蛋白脂肪酶活性的影响,实验控制反应温度30 °C、pH8.0。使用Tris-HCl (50 mmol/L,pH8.0 )配制浓度为4 mol/L的NaCl溶液,设置不同的NaCl浓度(220 µL体系里摩尔体积浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0和1.5 mol/L)分别加入到100 µL重组蛋白中孵育30 min,孵育结束后,加入到96孔酶标仪中,每孔加入11 µL底物溶液,最后加入Tris-HCl (50 mmol/L,pH8.0)至体系总体积为220 µL,每组设置3个平行,设置1组用灭菌水替代蛋白样品的对照组,30 °C条件下孵育5 min,在410 nm处测定各孔吸光值,记录孵育后的初始吸光值,往后每10 min记录一次吸光值,反应60 min后终止反应。
三种CcLPLs重组蛋白的酶促动力学
为测定鲤重组脂蛋白脂肪酶Km值,实验控制反应温度为30 °C、pH8.0。以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)为底物,将配制好的p-NPP底物溶液(10 mmol/L)用Tris-HCl (50 mmol/L,pH8.0 )进行稀释,分别稀释至220 µL体系里浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.75、1.00和1.50 mmol/L,分别加入100 µL重组蛋白,最后加入Tris-HCl (50 mmol/L,pH8.0)至体系总体积为220 µL,每组设置3个平行,设置1组用灭菌水替代蛋白样品的对照组,30 °C条件下孵育5 min,在410 nm处测定各孔吸光值,记录孵育后的初始吸光值,往后每10 min记录一次吸光值,反应60 min后终止反应。
1.8 数据分析
使用SPSS 28.0软件对数据进行处理,用单因素方差分析,差异显著水平为P<0.05,极显著性差异为P<0.01,结果用平均数±标准差(mean±SD)来表示。
2. 结果
2.1 鲤CcLPLs序列分析
鲤CcLPLs共线性分析
使用Genomicus(v95.01)软件对斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、墨西哥丽脂鲤(Astyranax mexicanus)、电鳗(Electrophorus electricus)、罗非鱼(Oreochromis spp.)、青鳉以及鲤LPLs进行共线性分析(图1)。结果显示,雀鳝中,一条连锁群上存在2个LPL同源基因(LPLA1和LPLA2),LPLA1与LPLA2相邻并位于其上游,LPLs上游基因为CIB3、RAB8a和TPM4a,下游基因为SAFB、CALR3b、RAD23ab、EPS15L1a、KLF2a和AP1m1。经鱼类特有的基因组加倍(fish‐specific genome duplication,FSGD或3R)后,除了罗非鱼和青鳉外,其他鱼3R中均在另一条连锁群上出现了一个LPLB基因,独立位于一条连锁群上。鲤经常见特异性基因组复制 (common carp specific genome duplication, CcSGD)后出现了3条连锁群,LOC109090420连锁群上存在一个CcLPLBa基因,LHQP01004943连锁群上找到了2个LPL基因,CcLPLA1a为CcLPLA2a上游基因,LHQP01007358连锁群上也出现了2个LPL基因,CcLPLA1b为CcLPLA2b*上游基因,其中CcLPLA2b*经鉴定为假基因。
鲤CcLPLs氨基酸序列相似性分析
使用DNAMAN7.0对3种鲤CcLPLs与斑马鱼DrLPLs、智人HsLPL、褐家鼠(Rattu snorvegicus) RnLPL、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus) GaLPLs、罗非鱼OnLPL、草鱼CiLPL氨基酸序列同源性比较(表3),鲤3种CcLPLs中,CcLPLBa与CcLPLA1s氨基酸序列相似性最高,为64.0%,与CcLPLA2a的氨基酸相似性为50.8%,而CcLPLA2a与CcLPLA1s的相似性最低,仅为48.8%。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 48.8 64.0 88.8 49.9 63.2 59.9 60.0 67.9 49.4 48.8 53.6 2 50.8 47.1 81.4 50.7 51.4 51.7 45.0 65.1 67.5 48.0 3 65.1 50.3 85.8 58.2 59.0 60.4 49.0 50.4 65.9 4 48.1 65.7 60.1 59.8 67.3 47.6 48.8 88.2 5 50.0 53.2 53.5 46.5 65.9 67.7 48.3 6 56.9 57.7 61.6 48.0 50.1 65.0 7 92.2 57.1 51.7 54.5 59.7 8 56.8 52.0 54.8 59.4 9 46.0 48.3 66.5 10 79.5 47.8 11 48.4 12 注:右上角数据为相似性,1~3分别为鲤CcLPLA1s (ACN66301.1),CcLPLA2a (XP_026201401.1),CcLPLBa (XP_042575005.1);4~6分别为斑马鱼DrLPL1 (NP_571202.1), DrLPL2 (XP_002666287.3), DrLPLB (NC_007133.7);7. 智人HsLPL (NP_000228.1);8. 褐家鼠RnLPL (NP_036730.1);9~10分别为三刺鱼GaLPL1 (XP_040040562.1),GaLPL2 (XP_040040768.1);11. 罗非鱼OnLPL (NP_001266682.1);12. 草鱼CiLPL (ACN66300.1)。
Notes: The data in the upper right corner is percent identit, 1-3. CcLPLA1s (ACN66301.1), CcLPLA2a (XP_026201401.1), CcLPLBa (XP_042575005.1); 4-6. DrLPL1 (NP_571202.1), DrLPL2 (XP_002666287.3), DrLPLB (NC_007133.7); 7. HsLPL (NP_000228.1); 8. RnLPL (NP_036730.1); 9-10. GaLPL1 (XP_040040562.1), GaLPL2 (XP_040040768.1); 11. OnLPL(NP_001266682.1); 12. CiLPL (ACN66300.1).2.2 鲤CcLPLs基因表达
组织表达
使用qPCR测定CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa在鲤肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑、肠、脾脏7个组织中的表达水平。结果如图2所示,CcLPLA1s在肝脏中的表达量最高,显著高于其他组织,在脾脏中的表达量最低,显著低于其他各个组织(P<0.05),在脂肪、肌肉中的表达水平与心脏、脑、肠组织中的表达无显著性差异(P>0.05),但心脏组织中的表达量显著高于脑、肠组织(P<0.05)。CcLPLA2a在心脏与脂肪组织中的表达无显著性差异(P>0.05),但显著高于其余各组织中的表达量(P<0.05),在脑中的表达量与脂肪、肝脏、肌肉中的表达水平无显著性差异(P>0.05),但在脂肪中的表达量显著高于肝脏和肌肉(P<0.05),在肠道和脾脏中的表达水平最低,显著低于其他5个组织(P<0.05)。CcLPLBa在各个组织中的表达量都很低,并且无显著性差异(P>0.05)。另外,在各个组织中CcLPLA1s的表达量显著高于CcLPLBa(P<0.05),CcLPLA2a的表达水平显著高于CcLPLBa(P<0.05),在肝脏、肌肉、肠组织中CcLPLA1s与CcLPLA2a的表达水平存在极显著差异(P<0.01),在脂肪和脾脏组织中CcLPLA1s的表达量显著高于CcLPLA2a(P<0.05),而在心脏和脑组织中,CcLPLA1s与CcLPLA2a表达水平无显著差异(P>0.05)。
饥饿和再投喂对CcLPLs表达的影响
肝脏组织中,鲤正常摄食24 h CcLPLA1s和CcLPLA2a表达量显著高于正常摄食1、3和6 h表达量(P<0.05);饥饿状态下,CcLPLA1s和CcLPLA2a表达水平无显著性差异(P>0.05),但CcLPLA1s的表达量显著高于正常投喂时表达量(P<0.05),CcLPLA2a显著高于正常摄食1、3和6 h的表达量;再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a的表达水平与禁食期间相比显著下降(P<0.05),再投喂72 h时的表达水平显著高于再投喂54 h的表达水平(P<0.05)(图3-a, b)。
肌肉组织中,CcLPLA1s和CcLPLA2a表达量在鲤正常摄食6 h显著高于正常摄食1、3和24 h表达量(P<0.05),在1 、3和24 h时表达水平无显著性差异(P>0.05);饥饿状态下,CcLPLA1s和CcLPLA2a表达水平显著低于正常摄食6 h表达量(P<0.05),其余各时间点无显著性差异(P>0.05);再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a表达水平迅速升高,显著高于禁食期间的表达量(P<0.05),但再投喂72 h时,显著低于再投喂54 h的表达水平(P<0.05)(图3-c, d)。
脂肪组织中,CcLPLA1s表达量在鲤正常摄食3和6 h显著高于正常摄食1和24 h表达量(P<0.05),饥饿状态下的表达水平显著低于投喂组的表达水平(P<0.05),在饥饿期间期间各时间点表达量无显著性差异(P>0.05);CcLPLA2a表达量在鲤正常摄食6 h显著高于正常摄食1、3和24 h及饥饿时的表达量(P<0.05),饥饿期间各时间点的表达水平无显著性差异(P>0.05);再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a表达水平迅速升高,显著高于饥饿组的表达量(P<0.05),再投喂72 h时,显著低于再投喂54 h的表达水平(P<0.05)(图3-e, f)。
2.3 重组蛋白的表达
将成功构建的Skp-pET、SlyD-pET、Skp-CcLPLs-pET和SlyD-CcLPLs-pET质粒分别在大肠杆菌 Transetta (DE3)中表达,在25 °C、0.1 mmol/L IPTG、180 r/min条件下诱导12 h后,将不加IPTG诱导的对照组与经IPTG诱导的总菌、上清液进行SDS-PAGE。结果显示,与未加IPTG诱导组比较,重组蛋白Skp-CcLPLA1a (72.46 ku)、Skp-CcLPLA2a(70.79 ku)、Skp-CcLPLBa (75.44 ku)、SlyD-CcLPLA1a (77.62 ku)、SlyD-CcLPLA2a (75.96 ku)、SlyD-CcLPLBa (80.60 ku)、Skp (15.96 ku)和SlyD (21.12 ku)在各自分子量处均有一条特异性表达的条带,与预测条带大小一致(图4)。使用Image Lab定量分析系统对目的条带进行灰度分析,结果显示,Skp-CcLPLA1a和Skp-CcLPLBa的总蛋白表达量分别比SlyD-CcLPLA1a和SlyD-CcLPLBa的总蛋白表达量高,但Skp-CcLPLA1a和Skp-CcLPLBa的可溶性蛋白表达量分别低于SlyD-CcLPLA1a和SlyD-CcLPLBa的可溶性蛋白表达量;Skp-CcLPLA2a和SlyD-CcLPLA2a总蛋白表达量相差不大,但Skp-CcLPLA2a可溶性蛋白表达量高于SlyD-CcLPLA2a可溶性蛋白表达量。Skp-CcLPLs可溶性蛋白占总蛋白比例从高到低依次为Skp-CcLPLBa、Skp-CcLPLA1a和Skp-CcLPLA2a;SlyD-CcLPLs可溶性蛋白占总蛋白比例从高到低依次为SlyD-CcLPLBa、SlyD-CcLPLA1a和SlyD-CcLPLA2a。
2.4 重组蛋白的表达纯化及浓度确定
可溶性蛋白的纯化
可溶性蛋白的纯化 将获得的上清液蛋白分别使用镍柱纯化(图5),重组蛋白与镍柱结合率低并有杂蛋白伴随产生。
从包涵体蛋白种纯化可溶蛋白
本实验在大肠杆菌沉淀蛋白中加入含6 mol/L尿素的裂解液,轻轻摇匀后,溶液变得澄清透明,低温离心,留上清液,使用0.22 µm滤膜过滤后,通过镍柱纯化,并直接使用含不同浓度咪唑的非变性裂解液进行目的蛋白的洗脱。结果显示,分别获得了较高纯度的重组蛋白(图6)。采用BSA法对蛋白浓度进行确定,经SDS-PAGE蛋白电泳检测,结果显示,每获得1 g总菌可以从其包涵体中获得纯化的重组蛋白量从高到低依次为SlyD、Skp、SlyD-CcLPLBa、Skp-CcLPLBa、SlyD-CcLPLA1a、Skp-CcLPLA1a、SlyD-CcLPLA2a和 Skp-CcLPLA2a,质量分别为0.62、0.60、0.49、0.44、0.31、0.24、0.16 和0.12 mg。
2.5 三种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性测定
实验对Skp、SlyD 2种标签蛋白和3种CcLPLs重组蛋白进行脂肪酶活性测定,结果显示,Skp和SlyD均没有脂蛋白脂肪酶活性,而Skp-CcLPLs和SlyD-CcLPLs脂蛋白脂肪酶活性各不相同(图7)。3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶比活力从高到低依次为SlyD-CcLPLA1a、Skp-CcLPLA1a、Skp-CcLPLBa、Skp-CcLPLA2a、SlyD-CcLPLBa和SlyD-CcLPLA2a,分别为(24.12±0.96)、(22.66±0.46)、(21.48±0.47)、(21.13±0.46)、(18.07±0.39)和(16.49 ± 0.31) U/g。其中,Skp-CcLPLA1a的脂蛋白脂肪酶活性显著高于Skp-CcLPLA2a酶活性(P<0.05),而Skp-CcLPLBa与Skp-CcLPLA1a、Skp-CcLPLA2a酶活性均无显著性差异(P>0.05);SlyD-CcLPLA1a酶活性显著高于SlyD-CcLPLBa(P<0.05),且SlyD-CcLPLBa的酶活性显著高于SlyD-CcLPLA2a酶活性(P<0.05)。Skp、SlyD对同一种脂蛋白脂肪酶活性的影响也不同,Skp-CcLPLA1a与SlyD-CcLPLA1a脂蛋白脂肪酶活性没有显著性差异(P>0.05),而Skp-CcLPLA2a、Skp-CcLPLBa脂蛋白脂肪酶活性分别显著高于SlyD-CcLPLA2a和SlyD-CcLPLBa的活性(P<0.05)。
2.6 pH对三种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性影响
pH 4.0~10.0范围内测定3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性(图8),Skp-CcLPLs和SlyD-CcLPLs脂蛋白脂肪酶活性最适pH均为8.0。
2.7 NaCl对三种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性影响
实验设置了0~1.5 mol/L NaCl浓度,测定NaCl对3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性的影响,结果见图9。NaCl浓度在0~0.6 mol/L范围内,Skp-CcLPLs和SlyD-CcLPLs脂蛋白脂肪酶酶活性逐渐升高,NaCl浓度在0.7、1.0和1.5 mo/L时,Skp-CcLPLs和SlyD-CcLPLs酶活性受到抑制。
2.8 三种CcLPLs重组蛋白酶促动力学
以p-NPP为底物,30 °C,pH 8.0条件下测定3种CcLPLs重组蛋白与不同浓度的底物反应的吸光值,根据实验得到的数据计算后进行线性拟合,以p-NPP底物浓度为横坐标,以反应速率V为纵坐标,作米氏方程曲线图(图10)。Skp-CcLPLs、SlyD-CcLPLs脂蛋白脂肪酶酶活性随着p-NPP底物浓度的增加而不断增大,直到p-NPP底物浓度增加至1.0 mmol/L时,Skp-CcLPLs、SlyD-CcLPLs脂蛋白脂肪酶酶活性分别达到最大。各重组蛋白的Km值及Vmax见表4。
重组蛋白
recombinant proteinKm /(mmol/L) Vmax /[µmol/(min·L)] Skp-CcLPLA1a 0.0731 4.044 Skp-CcLPLA2a 0.1857 4.394 Skp-CcLPLBa 0.0743 3.901 SlyD-CcLPLA1a 0.2639 6.244 SlyD-CcLPLA2a 0.1689 3.989 SlyD-CcLPLBa 0.0873 3.915 3. 讨论
3.1 鲤CcLPLs基因
鲤是典型的四倍体鱼类[36],本实验在鲤基因组中挖掘到了5个CcLPLs基因 (CcLPLA1a、CcLPLA1b、CcLPLA2a、CcLPLA2b*和CcLPLBa),其中CcLPLA2b*是假基因,这与同源基因在进化过程中会产生功能变化、表达调控变化及成为假基因的报道一致[37]。共线性分析揭示了染色体在加倍过程中出现了基因的丢失,3R鱼类经FSGD后,在斑马鱼、斑点叉尾鮰、墨西哥丽脂鲤和电鳗连锁群上均找到了LPL1、LPL2和LPLB 3种同源基因,但在罗非鱼和青鳉鱼中未找到LPLB基因,基因丢失现象在植物中也有过报道[38]。鲤经CcSGD后也发现了3种CcLPLs同源基因,其中CcLPLA1和CcLPLA2均存在2个旁基因,理论上CcLPLB应该也存在2个旁基因,但实验只发现了一条连锁群上存在CcLPLBa基因,关于另一条连锁群上是否存在CcLPLB的旁基因还有待进一步研究。
3.2 鲤CcLPLs组织表达
qPCR结果显示,CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa在鲤肝脏、心脏、肌肉、脂肪、脑、肠、脾脏7个组织中均有表达,但不同组织中的表达水平存在显著差异,在肝脏、心脏、脂肪、肌肉组织中的表达量较高,而在脾脏中的表达量较低,与刀鲚(Coilia nasus)[17]、彭泽鲫(Carassius auratus)[39]、斑马鱼[40]等LPL基因在多种组织中表达水平类似,表明了鲤LPLs具有组织表达特异性。本研究中CcLPLs在肝脏中有大量的表达,这与草鱼[15]、花鲈( Lateolabrax maculatus)[19]等鱼类中肝脏LPL有较高表达水平结果一致,但与成年哺乳动物肝脏LPL低表达结果恰好相反[41],这可能与肝脏是鱼类储存脂肪的重要组织有关[42]。同源基因在进化过程中存在表达模式差异[37],在不同组织中,CcLPLA1s、CcLPLA2a和CcLPLBa的表达水平存在差异,推测3种CcLPLs在功能方面可能存在差异。
3.3 饥饿和再投喂对CcLPLs表达的影响
研究表明,鱼类可以通过摄食控制各组织LPL表达水平的高低来决定各组织脂质代谢底物的分配量,LPL的合成和分泌受到底物量的影响[43]。肝脏、肌肉、脂肪被认为是硬骨鱼类脂肪储存的重要组织[42-44],因此,本实验测定了鲤正常投喂、饥饿和再投喂后CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏、脂肪、肌肉的表达水平。与正常投喂组相比,饥饿组,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中的表达量显著升高,真鲷[21]、罗非鱼[45]等饥饿后,肝脏中LPL的表达水平也明显上调,可能是鱼类受到饥饿后,肝脏脂质被用来为机体提供能量。鲤经再投喂后,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中的表达量迅速下降至与正常摄食组无显著差异,Oku等[21]对在真鲷再投喂6 h,肝脏LPL表达水平至正常投喂组的水平,本实验的发现与Oku等[21]研究结果类似,说明重投喂抑制了因饥饿引起的肝脏中脂质的分解并获得了脂质的补充。与投喂组相比,鲤在受到饥饿后,CcLPLA1s和CcLPLA2a在肌肉组织和脂肪组织中的表达水平呈现下降趋势,但在再投喂后,肌肉和脂肪组织中CcLPLA1s和CcLPLA2a的表达水平显著升高,在再投喂72 h后,再次下降,表明鲤重摄食后,营养得到了补充,促使鱼体各项生理机能得到了恢复。
3.4 重组蛋白的表达及纯化
大肠杆菌原核表达是真核基因在体外获得蛋白常用方式[46],但是获得的蛋白往往是无活性的包涵体。研究表明,Skp和SlyD具有分子伴侣的功能[47-48],能够促进蛋白的正确折叠[28, 32],本实验对pET43.1a原核载体进行了改造,在该载体中分别插入了skp和slyD基因,构建了Skp-pET和SlyD-pET原核促溶载体,分别将目的基因CcLPLs插入到Skp-pET和SlyD-pET载体上,在最适诱导条件下获得CcLPLs重组蛋白,结果显示,Skp和SlyD均能促进CcLPLs的可溶性表达,这意味着Skp和SlyD能够有效地促进CcLPLs蛋白质的正确折叠,且SlyD对CcLPLA1a和CcLPLBa的促溶效果好,而Skp对CcLPLA2a的促溶效果则更好,Lee等[49]曾探究了泛素(ubiquitin,Ub)、硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)和NusA 4种不同的标签蛋白对人肾素结合蛋白(human renin binding protein, hRnBP)促溶效果,结果显示,只有MBP和Trx能够促进hRnBP的可溶性表达,且MBP的促溶效果明显高于Trx,这与本实验结果相似,表明了不同标签蛋白对同一目的蛋白的促溶效果不同。获得可溶性蛋白后,实验首先对可溶性的蛋白使用镍柱进行纯化,但纯化不到目的蛋白,推测是6His结构包裹到了重组蛋白的内部[50]。考虑到Skp和SlyD的促溶作用,实验又对包涵体蛋白进行了变性处理,将变性后的上清液直接挂镍柱,然后通过不含咪唑裂解液进行洗脱目的蛋白,结果获得了较高纯度的目的蛋白,Rashid等[51]报道,β-丙氨酸、二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇化学伴侣能够重新激活尿素变性的二氢叶酸还原酶(zebrafish dihydrofolate reductase, zDHFR),该结果与本实验的结果类似,推测Skp和SlyD具有辅助变性蛋白复性的作用。
3.5 三种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性
本实验使用对硝基苯酚法测定各重组蛋白的酶活性,结果Skp-CcLPLA2a和Skp-CcLPLBa均显著高于SlyD-CcLPLA2a和SlyD-CcLPLBa的脂蛋白脂肪酶活性,推测Skp和SlyD与鲤CcLPLs会发生相互作用,进而影响了CcLPLs酶的活性[52]。pH是影响脂肪酶活性的一个重要因素[53],本实验测定的各重组蛋白的最适是pH 8.0,与鲜牛乳中LPL最适pH为8.0~8.5结果一致[54],推测脂蛋白脂肪酶在偏碱性条件下可以发挥其最大的催化活性。研究表明,NaCl对脂蛋白脂肪酶活性有影响[55-56]。适宜浓度的NaCl可以用来保持LPL的活性,而过高的NaCl浓度则会抑制LPL的活性[54]。Bengtsson-Olivercrona等[55]的研究表明脂蛋白脂肪酶在0.5 mol/L NaCl中比在0.1 mol/L NaCl中的活性高,高浓度NaCl中酶活受到抑制;Vilaró等[57]对高浓度NaCl能够抑制脂蛋白脂肪酶活性进行了报道,1.5 mol/L NaCl可以高度抑制大鼠脂肪组织中LPL的活性。在本实验中也得到了类似的结果,低浓度NaCl中(0~0.6 mol/L),3种CcLPLs重组蛋白的脂蛋白脂肪酶活性逐渐升高,而高浓度NaCl中(1.0和1.5 mol/L),Skp-CcLPLs和SlyD-CcLPLs酶活受到明显抑制,说明NaCl浓度为0.6 mol/L时,3种CcLPLs能发挥最大活性。
综上,本实验结果表明,硬骨鱼类LPL基因在FSGD过程中存在丢失;qPCR结果表明,CcLPLs在各个组织中均有表达,且在肝脏、心脏、肌肉、脂肪中表达量显著高于其他组织,CcLPLA1s和CcLPLA2a的表达量显著高于CcLPLBa;饥饿会导致鲤CcLPLA1s和CcLPLA2a在肝脏中的表达水平升高,在肌肉和脂肪中的表达水平降低,再投喂后CcLPLA1s和CcLPLA2a的表达水平得到恢复;重组CcLPLs蛋白的酶活性从高到低依次为CcLPLA1a、CcLPLBa和CcLPLA2a,最适pH为8.0,能够发挥最大活性的NaCl浓度为0.6 mol/L。
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图 1 添加恩诺沙星与氟苯尼考饲料对草鱼后肠分析抗氧化酶活性
(a) SOD,(b) GPx,(c) CAT,(d) MDA;1. 对照,2. 恩诺沙星,3. 氟苯尼考;*. P < 0.05,**. P < 0.01,下同。
Figure 1. The antioxidant enzyme activities in the hindgut of C. idella fed with dietary enrofloxacin and florfenicol
(a) SOD, (b) GPx, (c) CAT, (d) MDA; 1. control,2. enrofloxacin,3. florfenicol;*. P < 0.05, **. P < 0.01, the same bwlow.
图 2 添加恩诺沙星与氟苯尼考饲料对草鱼肠道免疫相关因子(a)和肠道黏膜蛋白(b)的定量分析
Figure 2. The mRNA relative expressions of intestinal immune related factors (a) and intestinal mucosa proteins related factors (b) of C. idella treated with dietary enrofloxacin and florfenicol
(a) 1.TNFα, 2. IL-1β, 3. IL-12, 4. TLR4, 5. NF-κB-P65, 6. MHC Ⅱ, 7. sIgM; (b) 1. ZO-1, 2. ZO-2, 3. ZO-3, 4. occludin, 5. CLDN-1, 6. CLDN-6, 7. JAM3.
图 3 饲喂添加恩诺沙星及添加氟苯尼考饲料的草鱼肠道菌群α多样性
(a)每个样品共同和独有OTU数的韦恩图,(b)基于OTU聚类阈值为97 %相似性的不同分组的稀薄曲线,(c) Shannon指数,(d) Chao 1指数,(e) Simpson指数;多样性指数都是基于Kruskal-wallis算法;ns. 差异不显著(P > 0.05);下同。
Figure 3. α diversity of the intestinal flora of C. idella fed with dietary enrofloxacin and florfenicol
(a) The Venn diagram of the number of common and unique OTUs for each sample, (b) rarefied curve of different groups based on the OTU clustering threshold of 97% similarity, (c) Shannon index, (d) Chao 1 index, (e) Simpson index; diversity index is based on Kruskal-wallis algorithm; ns. indicates that the difference is not significant (P > 0.05); the same below.
图 6 饲喂恩诺沙星及添加氟苯尼考的草鱼肠道菌群差异物种分析
(a)属水平上差异物种热图,c、e 和 f 分别表示对照组、恩诺沙星组和氟苯尼考组;(b)希瓦氏菌属;(c)气单胞菌属;(d)肠球菌属。
Figure 6. Analysis of the different species of the intestinal flora of C. idella fed with dietary enrofloxacin and florfenicol
(a) The heat map of different species at genus level, c, e and f denote the control, enrofloxacin and florfenicol groups, respectively, (b) Shewanella, (c) Aeromonas, (d) Enterococcu.
表 1 实验所用引物
Table 1 Primers used in the experiments
基因
genes引物名称
primers序列(5′-3′)
sequences (5′-3′)应用
applicationTNF-α TNF-α-F CGTATGGCGGGTGTGTGG qRT-PCR TNF-α-R AAAGCCTGGTCCTGGTTC IL-1β IL-1β-F GTGTCTGGCCATTTCCAAGAGTA qRT-PCR IL-1β-R GGTGTTGAGAGTTTCAGTGACCT IL-12 IL-12-F ACCATCTTCCTACTTCCC qRT-PCR IL-12-R ACAGGTTCCATTCACTCC TLR4 TLR4-F GAATAATGGGCAGCCGTAAAGTC qRT-PCR TLR4-R TCCTCTCTTCCACATCTTCCAGA NF-κB-P65 NF-κB-P65-F TATTCCTGAAGCGAAGATCTGGG qRT-PCR NF-κB-P65R TTGGAGCTCTGTTGTCGTAGATG sIgM sIgM -F CTTTCACTCCGATGTATCACGC qRT-PCR sIgM -R TGAAACGATGACCCTGACATGT JAM3 JAM3-F GTTAGTGTGATGATGTGTGGCTG qRT-PCR JAM3-R CGTCGAGCAGGTGATAAATTGTC ZO-1 ZO-1-F GTGAAAACACCCAGTGACATCAG qRT-PCR ZO-1-R CAATCTCCCAGGTGTCTAAAGCT ZO-2 ZO-2-F GTGTTTCAAGTGTGGGTATCTGC qRT-PCR ZO-2-R GTTGTAACAGGTGTGTCGAAAGG ZO-3 ZO-3-F AAGCACCTAACCCTGGATGTAAG qRT-PCR ZO-3-R AGATTACCTCTGGGATCAGGTGA occludin occludin-F GCAGTACGGATTAGGTTACGGAT qRT-PCR occludin-R GTAAGGGGTCGGGTAAGAATTGT CLDN-1 CLDN -1-F GCAGTACGGATTAGGTTACGGAT qRT-PCR CLDN-1-R GTAAGGGGTCGGGTAAGAATTGT CLDN-6 CLDN-6-F CATCGGGAACAACATTGTAACGG qRT-PCR CLDN-6-R GTACAGATGAGCAAAGCGAGAAC MHC Ⅱ MHC Ⅱ-F CGACTTCTACCCTCAACC qRT-PCR MHC Ⅱ-R GGCGTGCTCCACCATACA β-actin β-actin-F ACCCACACCGTGCCCATCTA qRT-PCR β-actin-R CGGACAATTTCTCTTTCGGCTG 16S rRNA V3-V4 343F TACGGRAGGCAGCAG Illumina测序 798R AGGGTATCTAATCCT -
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